登革熱IgM捕獲法elisa試劑盒

登革熱IgM檢測試劑盒預期用途

DENV Detect IgM-ELISA檢測試劑是一種用來定性檢測人是否感染登革熱病毒的ELISA檢測系統，它可以檢測出人血清中是否存在抗登革熱病毒源性重組抗（DENVRA I-IV）的IgM抗體。此診斷實驗可輔助診斷人是否感染了登革熱病毒。此試劑盒不能用于篩查血液或血液成分，僅供體外診斷用。

登革熱IgM試劑盒檢測原理

DENV Detect IgM ELISA試劑盒是由一種酶聯擴大的兩步法免疫檢測系統。在此實驗中，將登革熱檢測陰性質控（代表不反應的血清）、陽性質控和未知抗體濃度的血清樣品加入到包被了抗人IgM抗體的微孔中溫育，之后分別加入登革熱源性重組抗原DENVRA（I-IV）和正常細胞抗原（NCA）進行溫育。登革熱IgM試劑盒的血清樣品必須用樣品稀釋液進行稀釋。溫育并洗板后，用HRP標記的DENVRA（I-IV）特異性抗體處理。第二次溫育并洗板后，加入TMB底物液進行溫育。之后再加入酸性終止液，450nm處測OD值可確定底物反應的程度。當高于一定數值時（臨界值），樣品的吸光度值可確定樣品中是否存在登革熱抗體。

注意：陰性質控和弱陽性質控以內在質控形式提供，其目的是為了監測試劑盒成分的完整性。

登革熱檢測特定材料
1.抗人IgM包被的包被板：帶板蓋的板架，抗人IgM包被的96孔包被板。2-8℃下儲存，有效期內穩定。抗人IgM包被的微孔可捕獲人樣品中的IgM抗體。
2.樣品稀釋液：1瓶，25ml，含吐溫20的Tris-HCl緩沖液，0.05%的Proclin-300防腐劑。用于試驗樣本，陰性質控和陽性指控的稀釋，2-8℃下儲存，有效期內穩定。
3.即用型的登革熱重組抗原：1瓶，3ml，含吐溫20的Tris-HCl緩沖液，0.05%的Proclin-300防腐劑，2-8℃下儲存，有效期內穩定。
4.即用型正常細胞抗原（NCA）：1支，3ml，含吐溫20的Tris-HCl緩沖液，0.05%的Proclin-300防腐劑，COS-1細胞上清。，2-8℃下儲存，有效期內穩定。
5.登革熱檢測陰性質控：1支，50ul的陰性血清，登革熱檢測陰性質控可輔助監測試劑盒的完整性。2-8℃下儲存，有效期內穩定
6.登革熱檢測陽性質控：1支，50ul的陽性血清，登革熱檢測弱陽性質控可輔助監測試劑盒的完整性。2-8℃下儲存，有效期內穩定
7.10倍濃縮洗滌液：1瓶，120ml，含吐溫20的磷酸緩沖鹽，2-8℃下儲存，有效期內穩定。
8.HRP標記的即用型酶聯物，1瓶，6ml，HRP標記的黃熱病毒活性單克隆抗體，含吐溫20的Tris-citrate緩沖液，＜0.01%的硫柳汞防腐劑和添加劑，2-8℃下儲存，有效期內穩定。
9.Enwash：1瓶，20mlEnwash溶液，含吐溫20的磷酸緩沖鹽，2-8℃下儲存，有效期內穩定。
10.TMB底物液：1瓶，9ml，2-8℃下儲存，有效期內穩定。注意：底物液必須始終儲存于避光試劑瓶中。
11.終止液：1瓶，內含6ml即用型的終止液，2-8℃下儲存，有效期內穩定。
注意：強酸，請戴保護手套、口罩和安全鏡，按照安全條理處理所有的材料。


登革熱IgM檢測實驗所需器材但試劑盒不提供
■可在450nm處讀數的酶標儀
■生物學或高純度水
■真空泵
■洗板機
■1-10ul的單道移液器，50-200ul的單道和多道移液器。
■聚丙烯試管
■Parafilm封口膜
■計時器
■旋渦混合器

登革熱IgM檢測試劑盒檢測步驟
1.陽性質控、陰性質控必須做雙孔檢測，未知樣本血清可做單孔或雙孔檢測（DENV和NCA都得做）。按照說明書上的操作流程圖進行操作。如果做雙份檢測的話，96孔板可做22個樣品。
2.將實驗中使用的板條標記好。
3.用試劑盒提供的樣品稀釋液將血清和質控品稀釋100倍。用小聚丙烯試管進行稀釋，稀釋時至少需要4ul血清、陽性質控和陰性質控。如：4ul血清加396ul稀釋液。
4.用單道或多道移液器將稀釋好的血清、陰性質控和陽性質控各50ul加入到相應的微孔中。如下為22個樣品做雙份檢測時的示范圖。注意，所有的樣品都必須用DENVRA和NCA檢測。
5.用封板膠僅在開放的微孔表面封板，所有板條的底部是沒有覆蓋的。
注意：這樣是為了保證溫度的分布在每個孔的底部和血緣相等地散播。一旦頂部密封阻礙了蒸發，任何多余的封板膠必需被剪掉。
6.37℃下保濕溫育板條1小時，注意：不要將微孔板疊放，必須單獨地分層平輔。這對于溫度的平等分布非常重要。不要使用CO2或任何氣體，不要讓板條接觸任何濕潤的物質，如濕紙巾等。
7.溫育后，用洗板機洗板6次，每次每孔300ul。
8.在A-D條中加入50ul DENVRA（I-IV），在E-H條中加入50ul NCA。
9.用封板膠僅在開放的微孔表面封板，所有板條的底部是沒有覆蓋的。（同步驟5）
10.37℃下保濕溫育板條1小時。（同步驟6）
11.溫育后，用洗板機洗板6次，每次每孔300ul。
12.用多道移液器在每一微孔中加入50ul HRP標記的酶聯物。
13.用封板膠僅在開放的微孔表面封板，所有板條的底部是沒有覆蓋的。（同步驟5）
14.37℃下保濕溫育板條1小時。（同步驟6）
15.溫育后，用洗板機洗板6次，每次每孔300ul。
16.用多道移液器在每一微孔中加入150ul Enwash溶液。
17.室溫下溫育（無需蓋板）5min。
18.溫育后，用洗板機洗板6次，每次每孔300ul。
19.用多道移液器在每一微孔中加入75ul TMB底物液。
20.室溫避光溫育10min。
21.溫育后，用多道移液器在每一微孔中加入50ul終止液，室溫溫育1min。
22.溫育后，450nm處測  OD值。

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