大鼠TNF αELISA檢測試劑盒
日本IBL進口原裝   貨號:27194  規格：96T
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前言簡介
腫瘤壞死因子α是分子量為17.5 kDa,由157個氨基酸組成的強效淋巴因子,在各種腫瘤細胞和靶細胞發揮著細胞毒素作用. 腫瘤壞死因子α在炎性前癥發揮關鍵作用,并能在患有風濕性關節炎病人的骨滑液中檢測到.它是免疫調節作用的初始調節者. 腫瘤壞死因子α的分泌是經過嚴格控制的,由極小量的休眠細胞分泌,主要為激活細胞的分泌因子.
原理
此試劑盒運用了兩種特異性抗體,洗板后加入TMB底物液顯色,顯色的強度與大鼠腫瘤壞死因子α的量成正比.
 
檢測范圍
56.25 ～3,600 pg/mL
 
預期用途
 
■此IBL試劑盒能用于大鼠細胞培養上清中腫瘤壞死因子α的定量檢測
■重組和天然的大鼠腫瘤壞死因子α都能檢測
 
試劑盒成分
1  預包被板:  抗大鼠腫瘤壞死因子α兔子IgG,親合純化             96T
2  酶標記抗體:
 （30倍濃縮）HRP標記抗大鼠腫瘤壞死因子α兔子IgG,親合純化      0.4mL x 1
3  標準品:      重組大鼠腫瘤壞死因子α                      1.0mL x 2     
4  EIA緩沖液:         含1% BSA, 0.05%吐溫20  BPS                       30mL x 1
5  標記抗體稀釋液:       含1% BSA, 0.05%吐溫20  BPS                  12mL x 1
6  顯色劑:                                 TMB底物液                                                15mL x 1
7  終止液:                                     1N硫酸                                                   12mL x 1
8  濃縮洗滌液:
 （40倍濃縮） 含1% BSA, 0.05%吐溫20  BPS                      50mL x 1
 
 
操作說明
1實驗所需器材（但試劑盒沒有提供）
  酶標儀（450nm）          微移液管及其槍頭
  量筒及燒杯             去離子水
  冰箱（4°C）               坐標紙（log/log）
  吸水紙                 試管（用于標準品稀釋）
  溫育箱（37°C ± 1°C）
  洗瓶（用于洗板）
  一次性試劑管（用于濃縮酶標記抗體和顯色劑）
 
2準備

1. 洗滌液的準備

試劑盒的洗滌液是一種40倍濃縮液,用1950 mL去離子水稀釋50 mL的濃縮洗滌液,制成2000mL即用稀釋洗滌液. 置于冰箱內可保存2周.

1. 酶標記抗體的準備

試劑盒中的標記抗體是一種30倍濃縮物,根據所需量,用標記抗體稀釋液稀釋30倍.
示例:
如果你用一條板（8孔）,就需800  μL.的標記抗體.就用870  μL的標記抗體稀釋液稀釋30  μL抗體濃縮液,充分混勻.并每孔各加100 μL
濃縮酶標記抗體需稀釋后才能用于實驗
剩余的稀釋標記抗體液需密封瓶裝,存于4°C

1. 標準品的準備

加1.0mL的去離子水到瓶裝標準品,制成濃度為7,200 pg/mL大鼠腫瘤壞死因子α標準品液

1. 標準品的稀釋

準備8支試管,并每支各加230 μL  EIA緩沖液.稀釋成如下濃度,步驟如下圖所示:
試管1                           3600 pg/mL
試管2                            1800 pg/mL
試管3                                              900 pg/ mL
試管4                                               450 pg/mL
試管5                                               225 pg/mL
試管6                                             112.5 pg/mL
試管7                                              56.25pg/mL
試管8                                   0 pg/mL（樣品空白對照）
吸取230ul的標準品液于1號管混勻，然后從1號管吸取230ul加入2號管混勻，如下圖所示,按此規律稀釋，系列標準品的濃度范圍為56.25-3600pg/mL,第8號管為0 pg/mL作為樣品空白對照

 

1. 樣品稀釋

 樣品如需稀釋時,必須用EIA緩沖液進行稀釋
 如果樣品中大鼠腫瘤壞死因子α的濃度范圍一無所知的話,預先準備幾個不同稀釋梯度的樣品液來確定*的檢測濃度.
 
 
 
3實驗步驟
使用前，將所有試劑應平衡至室溫，大約30min，充分混勻，確保試劑質量無改變，標準曲線和樣品檢測必須同時進行.
 

試劑	待檢測樣品	標準品	樣品空白	試劑空白
	檢測樣品100ul	稀釋標準品（1-7管）100ul	EIA緩沖液（第8管）100ul	EIA緩沖液100ul
蓋板，于4°C下溫育過夜
洗板7次
酶標抗體	100ul	100ul	100ul	-
蓋板，于4°C下溫育30min
洗板9次
顯色劑	100ul	100ul	100ul	100ul
室溫避光溫育30min
終止液	100ul	100ul	100ul	100ul
加終止液后,30min內于450nm處讀取OD值

1）設試劑空白對照，并于相應的微孔中加入100ul EIA緩沖液
2）  確定好樣品空白對照孔，檢測樣品孔和標準品孔，分別將100ul樣品對照品（8號管）、檢測樣品和稀釋好的標準品（1-7號管）加入到相應的微孔中。
3）蓋板，4°C下溫育過夜
4）用洗滌瓶劇烈洗板,再加入稀釋洗滌液,靜置15-30秒,再*倒去孔內反應液
重復洗板7次.
zui后在吸水紙上拍干,去除殘留液滴
如用自動洗板機洗板,先自動洗4次,再按上述用洗瓶手工洗3次
5）除試劑空白對照孔外,其余每孔各加100ul酶標抗體
6）蓋板，4°C下溫育30min
7）按照上述步驟4）洗板9次
8）  用一次性試管取所需量的顯色劑，各加100ul顯色劑于微孔中.為了避免污染，勿將剩余試劑在倒回試劑瓶中
9）室溫避光溫育30min，加入顯色劑后溶液顏色會變成藍色
10）每孔各加100ul終止液，溶液顏色會變成黃色
11）擦去微孔板底部的污跡或水滴，確保微孔內溶液無氣泡產生.加入終止液后30min內于酶標儀450nm處讀取結果
 
 
特別注意

1. 收集樣品后應盡快檢測. 如需保存, 凍存樣品,但要避免反復凍融.檢測前,將樣品解凍至室溫.
2. 如樣品需稀釋,用EIA緩沖液稀釋
3. 樣品和標準品建議做雙份檢測
4. 保持樣品處于中性PH范圍.有機溶劑的污染會影響實驗結果
5. 只能用本試劑盒提供的洗滌液洗板.不充足的洗板會導致錯誤的結果
6. 在吸水紙上拍干去除殘留液滴時,切勿用吸水紙刮擦孔內壁
7. 顯示劑應避光保存并避免與金屬物質接觸
8. 加終止液后,30 min內就應讀取實驗結果

 
結果計算
所有實驗數據（包括標準品,檢測樣品的OD值）,都應減去樣品空白對照的OD值.
在log-log坐標紙用,以較正的OD值為縱坐標,相對應的濃度為橫坐標,建立標準曲線. 樣品直接在標準曲線上獲取濃度值.
標準曲線示范

 
上圖所示典型標準曲線僅用于演示示范,不能用于試驗數據的獲取.每次實驗都應建立其標準曲線.
 
常規事項
1所有試劑置于2 - 8°C保存.實驗前將試劑平衡至室溫（約30分鐘）
2瓶裝標準品是凍干品,故小心打開瓶蓋
3終止液是強酸物質.使用時,避免其接觸皮膚和衣膚.
4棄置用過的物質前,用水沖洗
5 濃縮酶標抗體,EIA緩沖液和濃縮洗滌液可能會出現沉淀,但這并不會影響實驗
6使用試劑后應洗手
7切勿混用不同批號的試劑
8別使用過期的試劑
9試劑盒僅供研究用,不能用于臨床診斷.
存儲與有效期
存儲條件:2 - 8°C
有效期見試劑盒外包裝
本譯文僅供參考，詳情請以原文為準
 
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