CA72-4 ELISA試劑盒說明書
（德國DRG進口原裝：EIA5071）
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1、簡介
DRG CA72-4 ELISA試劑提供的材料用于在人體血清或血漿中定量檢測腫瘤相關抗原CA72-4 （TAG-72）。本實驗僅供體外診斷使用。
CA72-4（癌抗原72-4）zui初被描述為由B72.3識別的抗原因子。B72.3是由相應的原發腫瘤轉移后的膜萃取物免疫雜交生產的鼠單克 隆抗體。CA72-4被證實是1MDa的粘液樣糖蛋白，合成物稱為TAG72（腫瘤相關抗原72）。TAG72蛋白的分子量為48KD. 血清和血漿中的CA72-4的水平升高見于某些惡性疾病，包括胰、胃、膽、結腸、乳腺、卵巢、子宮頸、子宮內膜的腫瘤。它對胃腸道和卵巢的腫瘤有很高的診 斷學的敏感性。盡管在一些良性的疾病如風濕病和卵巢囊腫也發現有CA72-4的升高，但是臨床研究表明，對于胃腸道和卵巢腫瘤，特異性診斷高達95％。 CA72-4的水平和腫瘤的大小及分級緊密關聯。CA72-4是胃腸道腫瘤的病人選擇治療學的監測和隨后的護理的指標。另外合適的指標是CA199和 CEA，另外，CA72-4是卵巢腫瘤的病人選擇治療學的監測和隨后的護理的可靠性指標，尤其是對于CA125陰性的病人。
2、實驗原理
DRG公司的CA72-4酶免實驗是一種基于夾心法原理的固相酶免吸附實驗（ELISA）。反應板上的微檢測孔包被有能結合CA72-4分子上*抗原位 點的單克隆小鼠抗體。一份含有內源性CA72-4的病人樣本在包被孔中與酶聯物進行孵育，該酶聯物是一種聯結有辣根過氧化物酶的抗CA72-4抗血清。孵 育后，用洗滌液洗去未結合的酶聯物。結合上的辣根過氧化物酶的總量與樣本中CA72-4的濃度成正相關。加入底物溶液后，顯出的顏色強度與病人樣品中 CA72-4的濃度成正比。
3、試劑盒成分
1）微孔板：12x8孔，可拆，微孔中包被抗CA72-4 單克隆抗體。
2）標準品（標準品0-4）：5支 0.5ml，即用，濃度為0,3，20，50，100U/ml，內含無水銀防腐劑。
3）質控高&低：2支 凍干粉，0.5ml，見“試劑準備”，質控品的濃度及范圍請見試劑瓶標簽或質控單。內含無水銀防腐劑。
4）樣品稀釋液：一支，3ml，即用，內含無水銀防腐劑。
5）酶聯物：1支 14ml，標記辣根過氧化物酶的抗CA72-4抗體，內含無水銀防腐劑。
6）TMB底物液：一支 14ml，即用。
7）終止液：0.5M的硫酸，一支 14ml，即用，避免接觸終止液，以免刺激或著燒皮膚。
8）洗滌液（40X）：一支 30ml.
注意：用于樣品稀釋的樣品稀釋液應視需要而定。
4、實驗需要器材（但試劑盒不提供）
1） 酶標儀（450±10nm）。
2） 移液器
3） 吸水紙
4） 蒸餾水
5） 計時器
6） 坐標紙或是數據處理軟件
5、試劑的儲存與穩定性
未開啟的試劑在2-8℃下儲存，在保質期內保持其穩定性。不要使用過期的試劑。所有開啟了的試劑都應在2-8℃下儲存，微孔板需在2-8℃下儲存，一旦打開了微孔板的袋子，需小心地將其重新密封。
6、試劑的準備：
在使用前將所有的試劑和所需的板條平衡至室溫。
質控品：在凍干粉中加入0.5ml的蒸餾水使其復溶，并至少放置10min，在使用前充分搖勻。復溶后的質控品需在-20℃下儲存。
洗滌液：在30ml濃縮的洗滌液中加入1170ml的蒸餾水，zui終洗滌液的容積為1200ml。稀釋后的洗滌液在室溫下兩星期內保持穩定。
7、樣品的采集與存儲
本實驗可使用血清或血漿（使用EDTA或肝素抗凝）樣品，不要使用溶血﹑脂血﹑黃疸的樣品。注意：含疊氮鈉的樣品不能用于此實驗。
7.1樣品采集
血清：靜脈采血，允許使用凝血，在室溫下用離心法分離血清。全血未*凝固前請勿離心，接受了抗凝劑治療的病人血液可能需要更長的凝血時間。
血漿：將全血收集到含有抗凝劑的離心管內，收集后馬上用離心法分離。
7.2樣品的儲存
樣品蓋好蓋子后，可在實驗前2-8℃下儲存5天，要更長時間儲存，應在-20℃下凍存。在開始實驗前應避免反復凍融樣品。
7.3樣品的稀釋
在zui初的實驗中，要是樣品的濃度高于zui高標準品，則樣品應用按實驗步驟所描述的10倍或100
倍稀釋。在計算濃度時需乘以此稀釋系數。
例子：
a） 按1：10稀釋： 10ul的血清+90ul的樣品稀釋液（充分搖勻）。
b） 按1：100釋稀：10ul按a）稀釋的血清+90ul的樣品釋稀液（充分搖勻）
8、實驗步驟
8.1總論
1）在使用前所有試劑和樣品均需平衡至室溫，所有試劑要充分混合但不要起泡。
2）一旦實驗開始，所有步驟都必須進行到底而不能中斷。
3）對每種試劑﹑標準品和樣品使用一次性的吸嘴，以避免交叉污染。
4）吸光率決定于溫育時間和溫度，在開始實驗前，建議準備好所有的試劑，將需要檢測的微孔板固定在板架上，這些步驟保證每次加液步驟所需時間相同而沒有中斷。
5）按照一般的規律，酶反應時間與溫育時間和溫度成線性比例。
8.2操作步驟
每次實驗都應含有一條標準曲線
1）將實驗所需數目的板條固定在板架上。
2）用一次性吸嘴將20ul的標準品﹑質控品和樣品加入相應的檢測孔中。
3）每孔加入100ul的酶聯物。
4）*混合十秒，在此步驟里，充分搖勻十分重要。
5）不用封板，在室溫下溫育120分鐘。
6）快速棄去檢測孔中的內含物，每孔用400ul洗滌液洗板五次，在吸水紙上用力拍板以除去殘留的液體。注意：洗板步驟是否正確將直接影響到實驗的靈敏度和性。
7）每孔加入100ul的底物液。
8）在室溫下溫育30分鐘。
9）每孔加入100ul的終止液終止反應。
10） 在加終止液后十分鐘內，室溫下，于450nm處讀取吸光率。
9、結果計算
1）計算標準品﹑質控品和病人樣品的平均吸光率。
2）以吸光率為Y軸，濃度為X軸，按照從標準品中獲得的平均吸光率和其相對應的濃度值，繪制標準曲線。
3）利用樣品的平均吸光率，在標準曲線上得出其相應的濃度值。
4）自動方法：使用立方函數﹑四參數模式或雙對數的計算機程序可得到結果。
5）樣品的濃度可從標準曲線上直接獲取。樣品的濃度高于zui高標準品的濃度則需進一步稀釋。在計算樣品的濃度的時候，要乘以稀釋倍數。
下面是CA72-4 ELISA的標準曲線的典型例子。
| 標準品 | 吸光率（450nm） |
| 零標準品（0 U/ml） | 0.08 |
| 標準品1（3U/ml） | 0.19 |
| 標準品2（20 U/ml） | 0.59 |
| 標準品3（50 U/ml） | 1.16 |
| 標準品4（100 U/ml） | 2.02 |
本譯文僅供參考，詳情請以原文為準！
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