人環(huán)磷酸鳥苷酶聯(lián)免疫試驗

（德國IBL CM581021）

預(yù)期用途

此酶免試劑盒用于細胞裂解液，組織，血漿和尿液中cGMP的定量檢測

 

實驗原理

此試劑盒采用的競爭酶免法，游離的cGMP和乙酰膽堿酯酶標(biāo)記的cGMP共同競爭結(jié)合位點上一定量的cGMP特異性兔抗。由于標(biāo)記的cGMP量不變，隨著游離的cGMP的不同，標(biāo)記cGMP與兔抗結(jié)合，結(jié)合的量與孔內(nèi)游離的cGMP濃度成反比。兔抗-cGMP復(fù)合物再與預(yù)先包被在微孔板內(nèi)的鼠單抗抗兔IgG結(jié)合，洗板洗去未結(jié)合的復(fù)合物，然后加入底物顯色液，反應(yīng)液有明顯的黃色并在412nm處有強吸光度值，顯色強度與結(jié)合的標(biāo)記cGMP濃度成正比，而與游離的cGMP成反比。

 

試劑盒組成

 

實驗所需材料但試劑盒未提供

1.      酶標(biāo)儀 405-420nm

2.      可調(diào)節(jié)的移液管和可重復(fù)使用的吸量器

3.      超純水

4.      用于樣品準(zhǔn)備的其它器材

 

儲存條件和穩(wěn)定性

此試劑盒需按要求儲存于-20℃,并在有效期內(nèi)使用,有效期見盒外

 

實驗前準(zhǔn)備

緩沖液制備

所有緩沖液貯存在4℃至2個月

EIA緩沖液準(zhǔn)備

將1支EIA緩沖液（編號:400060）加90 ml超純水進行稀釋.確保沖洗掉瓶內(nèi)鹽類沉淀物.

洗滌液準(zhǔn)備

用2L的超純水稀釋5 ml400倍濃縮的洗滌液（96T試劑盒,編號:400062）,同時加入1 ml吐溫20（編號:400035） 或者 用5L的超純水稀釋12.5 ml400倍濃縮的洗滌液（400T試劑盒,編號:400062）, 同時加入2.5 ml吐溫20（編號:400035）

提示:由于吐溫20是粘性液體,所以不能用常規(guī)的移液管移液.需用位移移液管與注射器進行定量.

 

樣品準(zhǔn)備

一般情況下，尿液和組織上清液可用緩沖液稀釋，然后直接加入微孔內(nèi)。血漿，血清，全血和組織勻漿和其他非均勻的基質(zhì)可能會含有感染實驗的雜質(zhì)，在進行大量樣品檢測時是先進行干擾檢查。進行干擾檢測試驗時，稀釋1到2個檢測樣品，每個樣品兩個不同的稀釋比例，如果在zui后的cGMP濃度計算中兩個不同稀釋比例的樣品具有良好的相關(guān)性，則不需純化，否則需進行純化。由于多數(shù)樣品中都會含有磷酸二酯酶，樣品純化強制酶對cGMP的水解。

 

血漿（血清）純化

500ul的血漿加上2ml的冰乙醇混勻，室溫下放置5min，1500xg下離心10min以除去沉淀，將上清移至另一10ml的干凈試驗管。在真空離心機中或者氮氣氣流中干燥上清液，然后再加入500μl的EIA緩沖液溶（離心機能用來干燥提取物中的水分），確保所乙醇已經(jīng)除盡以免微量的乙醇影響檢測結(jié)果。

 

培養(yǎng)基樣品

組織和細胞上清無需純化可直接用于試驗。如果樣品中的cGMP濃度足夠高則需用緩沖液進行10倍的稀釋，試驗操作無需進行任何改動。當(dāng)樣品低濃度時（樣品無需緩沖液稀釋），稀釋同一培養(yǎng)基中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以達到樣品和標(biāo)準(zhǔn)品基質(zhì)達到相符合。我們建議要首先建立標(biāo)準(zhǔn)曲線以確保在特殊的樣品中試驗也可進行。

細胞液抽提

1.    提出培養(yǎng)基

2.    每35cm²表面區(qū)域加入1ml的0.1M的鹽酸

3.    室溫下孵育20min

4.    用刮刀將細胞從表面刮落

5.    用移液槍吹打混勻直至上清均勻，轉(zhuǎn)移至合適的離心管內(nèi)

6.    1000xg

這些上清可直接用于試驗

 

組織樣品

7.    組織中的循環(huán)核苷酸會立即分解，所以下離心10min

1.    上清倒入另一干凈試驗管內(nèi)采樣后應(yīng)將其立即冰凍

2.    冰凍組織稱量，滴加5-10個單位（液體/ml，組織/g）的TCA,用勻漿器將樣品混勻。

3.    1500xg下離心10min，去除沉淀，將上清移至另一干凈試驗管

4.    用水-飽和乙醚從樣品中抽提TCA。5體積的乙醚和1體積的上清，混合10秒，萃取分離，去除上層，重復(fù)抽提兩次以上。

5.    通過在70℃下加熱樣品以除去剩余的乙醚。

組織中提取的上清無需稀釋可直接用于試驗，標(biāo)準(zhǔn)曲線基質(zhì)液的準(zhǔn)備，抽提10ml 用乙醚處理過的5%的TCA，通過加熱除去剩余的乙醚，剩下的溶液檢測得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 

特異性試劑的制備

cGMP  AChE示蹤液

100dtn cGMP  AChE示蹤液與6ml的緩沖液

或500 dtn cGMP  AChE示蹤液與30ml的緩沖液

配制的cGMP示蹤液應(yīng)儲存在4℃下，4周內(nèi)有效

示蹤染料：加入染料可輔助目測觀察，在配制好的示蹤液中加入染料（60ul的染料加入到6ml的示蹤液中或是300ul染料和30ml的示蹤液）

cGMP抗血清

100dtn cGMP抗血清與6ml的緩沖液

或500 dtn cGMP抗血清與30ml的緩沖液

配制的cGMP抗血清應(yīng)儲存在4℃下，4周內(nèi)有效

抗血清染料：加入染料可輔助目測觀察，在配制好的抗血清中加入染料（60ul的染料加入到6ml的抗血清中或是300ul染料和30ml的抗血清）

無乙酰化的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的準(zhǔn)備

1ml的緩沖液配制cGMP標(biāo)準(zhǔn)品，終濃度為300 pmol/ml，貯存在4℃下，可保存6周。

標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備：準(zhǔn)備8個干凈試管，標(biāo)號，吸取900ul緩沖液至1號管，2-8號管加500ul緩沖液，吸取100ul bulk標(biāo)準(zhǔn)品（300 pmol/ml）至1號管，混勻，從1號管吸取500ul至2號管，混勻，依次進行稀釋。稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品貯存時間不能超過24h

如圖

樣品的準(zhǔn)備：如果樣品需要純化，則根據(jù)純化步驟完成，如無需純化，則無需進一步制備。但是樣品需要稀釋來確保其濃度保持在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性誤差范圍內(nèi)（20%-80%B/Bo）

 

標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的準(zhǔn)備----乙酰化

標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)備

用1mlEIA緩沖液重組標(biāo)準(zhǔn)cGMP，吸取100μl標(biāo)準(zhǔn)A到9.9ml的EIA中，此標(biāo)準(zhǔn)品的濃度是3pmol/ml

注意 如果樣品利用組織萃取法提取TCA，且不能用至少1:5的EIA來分析，利用乙醚萃取法提取TCA來準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)曲線。任何稀釋的樣品需要按此方法進行

用EIA準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)曲線： 取9個干凈試管依次編號#0至#8，吸取900μl到#0（只含有buffer），#2至#8加入500μlEIAbuffer，吸取1ml標(biāo)準(zhǔn)B（3pmol/ml）到#1 ，然后吸取500μl到#2中稀釋，混勻后，從#2中吸取500μl到#3中，混勻，以此類推，至#8，稀釋液保存不能超過24小時

樣品準(zhǔn)備

如果樣品需要純化，則在乙酰化之前進行純化（操作參照12-14的純化操作），雖然純化不是必需的，但我們建議將樣品純化以確保試驗的完整性。如果乙酰化的樣品少于500μl，必須加入一定體積的KOH，和適量的無水醋酸。

 

KOH準(zhǔn)備

配置4M的KOH溶液，溶解100dtnKOH到10ml的超純水或者500dtn到50ml的超純水中

乙酰化步驟（建立在500μl體系中）

#0-#8中所有的標(biāo)準(zhǔn)樣品必須乙酰化，每一個樣品/標(biāo)準(zhǔn)品都必須單獨的乙酰化。確保在同一條件下進行乙酰化是很重要的，混合時間的不同或者是加入KOH的時間有誤都會影響試驗結(jié)果。

500μl的樣品，快速加100μl 4M KOH和25μl的無水醋酸，混勻器中混勻15s，加入25μl 4M KOH并混勻，對其余樣品重復(fù)相同的操作。

注意 如果樣品含糖量>250mM，則應(yīng)該增加合適的KOH和無水醋酸的體積，以確保乙酰化的*反應(yīng)。

 

一般注意事項

檢測前樣品禁用有機溶劑進行預(yù)處理

樣品采集后需立即檢測,但在-80℃凍存的樣品需解凍,不可立即檢測.

建議布板如下:

 （可根據(jù)實驗的實際情況調(diào)整布局）

注釋:每塊板條都含用2個空白對照孔（Blk）,2個非特異性孔（NSB）,2個zui大值孔（B₀）. 8個標(biāo)準(zhǔn)品孔（雙份）,如下圖所示:

1.EIA緩沖液

加100 µl EIA緩沖液到非特異性包被孔中（NSB）,加50 µl到zui大值孔中（B₀）.如果加入培養(yǎng)基樣品是為了稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的,在非特異性包被孔（NSB）中和zui大值孔（B₀）加50µl培養(yǎng)基樣品,另加50 µl EIA緩沖液至NSB孔中.

2.標(biāo)準(zhǔn)品

加試管#8的50µl標(biāo)準(zhǔn)品至S8孔中.再加試管#7的50µl標(biāo)準(zhǔn)品至S7孔中.依次加入各標(biāo)準(zhǔn)品入相應(yīng)的孔中.

3.樣品

依次加50µl樣品于相應(yīng)各孔中,每個樣品至少有兩個稀釋比例.每個稀釋比例都做平行樣

4.酶聯(lián)物

加50µl酶聯(lián)物于相應(yīng)各孔中（TA孔和Blk孔除外）

5.cGMP抗血清

加50µl抗血清于相應(yīng)各孔中（TA孔和NBS孔,Blk孔除外）

 

用塑料薄膜（編號:400012）蓋板在室溫下孵育18h（或在4℃下孵育18h，可些許增加試驗靈敏度）

1.臨使用前復(fù)溶Ellman’s試劑（20ml的試劑足夠加100個試驗孔）。1支100dtn的Ellman’s試劑（Cat.400050）用20ml的超純水復(fù)溶。注意：復(fù)溶Ellman’s試劑不穩(wěn)定，只能即配即用且避光儲存。

2.棄去反應(yīng)孔中的反應(yīng)液，用洗液洗5次。

3.每個反應(yīng)孔加配制的Ellman’s試劑200ul.

4.加5ul示蹤試劑至TA孔內(nèi)。

5.用塑料膠片蓋板，在振蕩器上振蕩反應(yīng)60-90分鐘，若在4℃，則時間約為90-120分鐘。

1用干凈的紙巾擦去板條底部的指紋.

2移去塑料薄膜,但避免Ellman試劑濺射

3在405-420nm處讀數(shù).建議當(dāng)B₀孔的讀數(shù)在0.3-1.0  AU（減去空白孔后的值）范圍時才讀取樣本值.如果各孔的值超過1.5則應(yīng)洗板,加入Ellman試劑再孵育

重測.

結(jié)果計算

1.      NSB孔的OD均值

2.      B0孔的OD均值

3.      B0均值減去NSB均值，這就是校正的B0或是校正的zui大結(jié)合量

4.      計算剩下微孔的%B/B0（%樣品或標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)合量/zui大結(jié)合量）值，S1的吸收值減去NSB的吸收均值，然后除以校正B0值，乘以100即得到了%B/B0，

按此法重復(fù)計算剩余的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以標(biāo)準(zhǔn)品的%B/B0值為Y軸和cGMP的濃度為X軸繪制曲線，將數(shù)據(jù)代入到四參數(shù)方程式

計算每一個樣品的%B/B0值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式來計算樣品的濃度。樣品%B/B0值大于80%或小于20%則視為超出了標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，需重做，同一樣品的不同稀釋比例得到的結(jié)果相差甚大，則表明有感染，需純化。