抑制素B（INH—B）ELISA Kit酶免試驗說明書

美國進(jìn)口原裝RayBiotech（Cat:EIA-INB-1）

簡介

    抑制素B屬于TGF-β超家族，家族成員包括抑制素A，TGF-B，活化素，骨成型蛋白，其中抑制素與活化素相關(guān)性zui為密切。

    活化素和抑制素都是二聚體蛋白復(fù)合結(jié)構(gòu)，每個復(fù)合物都是由兩個單元結(jié)構(gòu)經(jīng)二硫鍵連接組成的。此外，兩個復(fù)合物都來自同一家族的相關(guān)基因和蛋白質(zhì)，但不同在他們的亞基組成，抑制素是由兩個不同的亞單位（a單元與b單元）經(jīng)二硫鍵連接形成

抑制素B是由一個alpha單元和一個betaB單元組成

抑制素A是由一個alpha單元和一個betaA單元組成

活化素有同構(gòu)二聚體和異構(gòu)二聚體，活化素A（2個betaA單元），活化素B（2個betaB單元），或者是活化素AB（1個betaA和一個betaB單元）

抑制素在生殖調(diào)節(jié)方面有著重要的作用。抑制素和活化素在作為生殖軸的調(diào)節(jié)器時通常發(fā)揮相反的作用，而在生殖生理學(xué)調(diào)節(jié)方面可發(fā)揮多種作用。zui近報道稱抑制素在腫瘤方面已有新發(fā)現(xiàn)。抑制素在多個細(xì)胞組織內(nèi)被報道為潛在的腫瘤基因，包括前列腺，卵巢，子宮內(nèi)膜和乳房，抑制素的低表達(dá)或低靈敏度都與腫瘤的起始和惡化相關(guān)聯(lián)

實(shí)驗原理

抑制素B酶免試劑盒用于抑制素B肽的定量檢測，依據(jù)的是競爭酶免法

包被板內(nèi)預(yù)包被了抗兔二抗， 抗抑制素B抗體經(jīng)封閉、孵育后，生物素標(biāo)記的抑制素B肽和標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中的目的肽會競爭結(jié)合抑制素B抗體，結(jié)合的生物素B肽與辣根過氧化物酶連接，會發(fā)生顏色改變。顏色強(qiáng)度與復(fù)合物的量成正比，而與標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中的抑制素B的量成反比。這是由于生物素標(biāo)記的抑制素B肽和標(biāo)準(zhǔn)品或樣品競爭結(jié)合抑制素B抗體。樣品濃度可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取

試劑盒組成

1.       包被板 96T，包被有二抗

2.       洗滌緩沖濃縮液（20X） 25mL

3.       標(biāo)準(zhǔn)品 2支，10µl/支

4.       抗抑制素B單抗 2支，5µl/支

5.       試驗稀釋液A  30mL，含0.09%的疊氮化物作為防腐劑，用于標(biāo)準(zhǔn)品和血清或血漿樣品的稀釋

6.       試驗稀釋液B  15mL，5X的濃縮緩沖液，用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和上清液或其他樣品

7.       生物素標(biāo)記物  2支，20µl/支

8.       辣根過氧化物酶濃縮液  8µl，20000X酶連液

9.       陽性質(zhì)控 1支，100µl

10.   TMB顯色液  12mL

11.   終止液  8mL，2M的硫酸

12.   坐標(biāo)紙

13.   說明書

儲存條件

標(biāo)準(zhǔn)品，生物素標(biāo)記物和陽性質(zhì)控應(yīng)保存在-20℃或者-80℃（建議-80℃），避免反復(fù)凍融

其他試劑保存在-20℃

開封的包被板和抗體在2-8℃下可保存1個月以上，不用的包被板應(yīng)重新裝入干燥的密封袋內(nèi)

實(shí)驗所需材料（但試劑盒未提供的）

所需材料省略！

試劑準(zhǔn)備

如果檢測的是血清或血漿，則用試驗稀釋液A稀釋生物素標(biāo)記物和標(biāo)準(zhǔn)品，如果檢測的是上清或其他樣品，則用試驗稀釋液B稀釋。

1.       試劑準(zhǔn)備階段都要在冰浴上進(jìn)行，打開密封袋之前包被板要平衡至室溫

2.       試驗稀釋液B需用去離子水稀釋5倍

3.       抗抑制素B抗體使用前應(yīng)離心，然后加入50µl 1X的試驗稀釋液B，移液槍吹打混勻，得到抗體濃縮液。

4.       抗體濃縮液再用1X的試驗稀釋液B稀釋100倍，這就是抗抑制素B抗體工作液。

5.       生物素標(biāo)記物使用前離心，然后吸取5µl與5mL的試驗稀釋液混合，zui終得到100pg/ml的生物素標(biāo)記物

6.       標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：一次標(biāo)記6個試管，濃度依次為10000pg/ml，1000pg/ml，100pg/ml，10pg/ml，1pg/ml和0pg/ml。除了10000pg/ml的試管外，其余每管加入450µl生物素標(biāo)記物。確保所有標(biāo)準(zhǔn)品中生物素標(biāo)記物的濃度是100 pg/ml很重要。

抑制素B先離心，然后吸取8µl抑制素B和792µl的100pg/ml生物素標(biāo)記物混合，這就得到了抑制素Bstock溶液,混勻，作為1號標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)記10000pg/ml，接下來可按如下圖進(jìn)行稀釋

7.       生物素標(biāo)記物進(jìn)行10倍稀釋，2µl的生物素標(biāo)記物和18µl的試驗稀釋液混合。

8.       陽性質(zhì)控：離心，在陽性質(zhì)控管內(nèi)加101µl的試驗稀釋液B，然后再加入4µl 10倍稀釋了的生物素標(biāo)記物，這就是2倍稀釋的陽性質(zhì)控。

9.       如果洗滌濃縮液含有可見沉淀物，將其平衡至室溫，搖晃直至溶解。20mL的洗滌濃縮液用蒸餾水稀釋至400mL 1X的洗滌緩沖液

10.   樣品：血清血漿樣品用試驗稀釋液A和生物素標(biāo)記物稀釋，而上清液和其他樣品則用1X的試驗稀釋液B和生物素標(biāo)記物稀釋。確保樣品中生物素標(biāo)記物的zui終濃度為100 pg/ml很重要

11.   過氧化物酶使用前應(yīng)進(jìn)行離心，用1X的試驗稀釋液B進(jìn)行20000倍的稀釋

實(shí)驗步驟

1.       試劑準(zhǔn)備階段應(yīng)在冰浴上進(jìn)行，所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣品都應(yīng)做一平行樣

2.       每孔內(nèi)加入100µl抗抑制素B抗體，室溫下振蕩孵育1.5小時，也可在4℃下孵育過夜

3.       棄去液體，用1X的洗滌緩沖液（200-300µl）洗滌4次，吸水紙上拍干

4.       標(biāo)準(zhǔn)品，陽性質(zhì)控和樣品各100µl加入相應(yīng)的孔內(nèi)，蓋板，室溫下振蕩孵育2.5小時，或是4℃過夜

5.       棄去液體，洗板4次

6.       每孔加入100µl的過氧化物酶溶液，室溫下孵育45min，孵育時間要把握好

7.       棄去液體，洗板4次

8.       每孔加入100µl的TMB底物液，暗處室溫下振蕩孵育30min

9.       每孔加入50µl的終止液，立即用酶標(biāo)儀讀數(shù)

結(jié)果計算

計算各標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控品和樣品的OD均值，減去空白組OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為X軸，吸光率為Y軸，坐標(biāo)紙上畫標(biāo)準(zhǔn)曲線。

吸收率=（B-OD_空白）/（B₀-OD_空白）

B=樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的OD值

B₀=零標(biāo)準(zhǔn)品的OD值

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準(zhǔn)。

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