泌乳素（PRL） ELISA試劑盒

（德國DRG：EIA1291）

1、實驗原理

   DRG公司的泌乳素酶免實驗是一種基于夾心法原理的固相酶免吸附實驗（ELISA）。反應(yīng)板上的微檢測孔包被有能結(jié)合泌乳素分子上*抗原位點的單克隆抗體。一份含有內(nèi)源性泌乳素的病人樣本在包被孔中與酶聯(lián)物進(jìn)行孵育，該酶聯(lián)物是一種聯(lián)結(jié)有辣根過氧化物酶的抗泌乳素抗血清。孵育后，用洗滌液洗去未結(jié)合的酶聯(lián)物。結(jié)合上的辣根過氧化物酶的總量與樣本中泌乳素的濃度成正相關(guān)。加入底物溶液后，顯出的顏色強(qiáng)度與病人樣品中泌乳素的濃度成正比。

2、試劑盒成分

1）       微量反應(yīng)板，1塊 （ 96孔） ，微孔中包被了抗泌乳素的單克隆抗體。

2）       酶聯(lián)物，11ml，辣根過氧酶標(biāo)記的泌乳素抗血清。 

3）       底物液，11ml （TMB）

4）       標(biāo)準(zhǔn)系列，6支（凍干粉），濃度：0；5；20；50；100；200ng/ml

轉(zhuǎn)換系數(shù)（1ng/ml=21.1mUI/mL）

5）       終止液，0.5M的 H2SO4，6ml

3、實驗需要器材（但試劑盒不提供）

1）       酶標(biāo)儀（450±10nm）。

2）       移液器

3）       吸水紙

4）       標(biāo)準(zhǔn)水箱

5）       蒸餾水

6）       計時器

4、試劑貯存:

   未開啟的試劑在2—8℃下貯存，在有效期內(nèi)可以保持活性。不要使用過期試劑，酶聯(lián)物、底物溶液、標(biāo)準(zhǔn)品和零標(biāo)準(zhǔn)品必須在2—8℃下貯存。

   微孔反應(yīng)板必須在2—8℃下貯存。一旦包裝袋被打開，必須將它小心地嚴(yán)封起來。如果包被板的包裝被打開，其免疫活性在2個月內(nèi)穩(wěn)定，但前提是必須將它密封在裝有干燥劑的袋子里。

5、樣品的采集

1）       靜脈穿刺采集全血，待其凝血，在室溫下用離心機(jī)分離血清，避免溶血。注意：此試劑盒只能使用沒用任何添加劑的樣品。

2）       必須蓋住樣本并在實驗之前于２-８℃下可貯存48小時。樣品需要更長的貯存時間，則應(yīng)將樣品凍存于-20℃的環(huán)境下。解凍的樣本在檢測之前必須上下倒置幾次。

注意：用于此試劑盒的樣品不能含有任何添加劑。

6、試劑的準(zhǔn)備

參考標(biāo)準(zhǔn)：在凍干的標(biāo)準(zhǔn)品中加入1.0ml雙蒸水。

注：配制好了的標(biāo)準(zhǔn)品可在2-8℃下穩(wěn)定存放2個月。想要存放更長時間應(yīng)當(dāng)將其凍存于-20℃的環(huán)境下。

7、一般注意事項

1）       實驗開始前，將所有試劑和樣本都平衡至室溫,試劑混合時避免起泡。

2）       實驗一旦開始,所有的步驟應(yīng)完整地進(jìn)行下去。

3）       每一樣品的取樣都得使用新的取樣吸頭。

4）       吸光度與溫育時間和溫度有關(guān)，在實驗開始后所有的試劑都應(yīng)準(zhǔn)備好，以保證加液時間的一致。

5）       本試劑盒zui大吸光度（OD）在1.200-2.000之間（室溫22℃,顯色10分鐘以內(nèi)）。如果zui大OD值高于您酶標(biāo)儀的上限或低于1.000，則相應(yīng)的減少或延長顯色反應(yīng)的溫育時間。一般情況下，酶免反應(yīng)的強(qiáng)度與時間和溫度成線性，這使得操作者應(yīng)當(dāng)適當(dāng)?shù)恼{(diào)整物理化學(xué)環(huán)境。

8、實驗步驟

1）       將所需數(shù)目的板條置于板架上。

2）       將黃體生成素標(biāo)準(zhǔn)系列（0；5；20；50；100；200ng/ml）、質(zhì)控和血清樣本分別25μl加入到相應(yīng)的微孔中，每一樣品都得使用新的取樣吸頭。

3）       加100μl的抗泌乳素酶聯(lián)物于各孔中。

4）       混勻10秒,此步驟中*混勻很重要。

5）       室溫溫育（22℃）30分鐘。

6）       棄去孔內(nèi)的反應(yīng)液。

7）       用蒸餾水洗板5次。

8）       在吸水紙上把板拍干。

9）       依原先加樣順序,每孔加100μl底物液。

10）   室溫（22℃）溫育10分鐘。

11）   按加底物液順序,每孔加50μl終止液于各孔中。

12）   10分鐘內(nèi)在450±10nm波長讀吸光度。

9、結(jié)果計算

1）       計算每個標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和病人樣本的平均吸光度值。

2）       用吸光度值作為縱坐標(biāo)（y），濃度值作為橫坐標(biāo)（x），以每個標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值對其相應(yīng)的濃度值（mIU/ml）進(jìn)行標(biāo)繪，作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3）       用每一樣品的平均吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定其相應(yīng)的濃度。根據(jù)自己的實際經(jīng)驗或計算機(jī)的功能，也可以采用其它的歸納方法進(jìn)行計算。

4）       如果樣本的濃度高于zui高濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度或者濃度＞200ng/ml，則需要進(jìn)行稀釋，任何稀釋了的樣品在計算時都必須將相應(yīng)的稀釋因子考慮進(jìn)去。

10、參考值

我們強(qiáng)烈建議各個實驗市都建立自己的正常值和異常值。以下結(jié)果是以一定量正常人群的血液樣本為準(zhǔn)得出的實驗結(jié)果：

靈敏度: zui小檢測出的泌乳素濃度為0.35ng/ml

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準(zhǔn)。

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