（一）冷凍管應(yīng)如何解凍 

 

取出冷凍管后，須立即放入37 ℃ 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，預(yù)防冷凍管的爆裂。

 

（二）細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，DMSO如何處理

 

在細(xì)胞解凍之后，可直接離心去除DMSO，用新鮮的培養(yǎng)基懸浮后直接放入含有 新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，如此可避免解凍后細(xì)胞生長(zhǎng)受到DMSO影響。

 

（三）可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基

 

每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無(wú)法存活，不應(yīng)該馬上替換。

 

（四）可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類

 

 血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生大的影響。來(lái)自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。

 

（五）何謂 FBS，F(xiàn)CS，CS，HS

 

FBS （fetal bovine serum） 和 FCS （fetal calf serum） 是相同的意思，兩者都是指胎牛血清。CS （calf serum） 則是指小牛血清。HS （horseserum） 則是指馬血清。

 

（六）培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用 5% 或 10% CO2

 

一般培養(yǎng)基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作為 pH 的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中 NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的 CO2 濃度。理論當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 含量為每公升 3.7 g 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用 10% CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 為每公升 1.5 g 時(shí)，則應(yīng)使用 5% CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。

 

（七）何時(shí)須更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中是否須添加***。

 

視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。

 

一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中可以添加***。 按1％體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U／mL和100 μ／mL。

 

(八）貼壁細(xì)胞傳代時(shí)所使用的 trypsin-EDTA 濃度及相應(yīng)處理

 

一般使用的 trypsin-EDTA 濃度為 0.25% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。**次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于 –20 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成 trypsin 的活性降低，并可減少污染的機(jī)會(huì).。

 

（九）將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái)，離心速率多少

 

回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為 1 000 rpm，5~10 分鐘，過(guò)高的轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。

 

（十）細(xì)胞的接種密度

 

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)的重要原因之一。

 

（十一）細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基的成分及DMSO的等級(jí)

 

動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)*常使用的冷凍培養(yǎng)基是含 5~10% DMSO （dimethyl sulfoxide） 和 90~95 % 原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意：由于 DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能，故不可將 DMSO 直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。冷凍保存使用的 DMSO 等級(jí)，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO ，其本身即為無(wú)菌狀況，**次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中避光保存。

 

（十二）冷凍保存細(xì)胞的方法及冷凍細(xì)胞濃度

 

將貼壁細(xì)胞消化后離心收集，懸浮細(xì)胞直接離心收集，以含有DMSO*培養(yǎng)基或胎牛血清的凍存液重懸細(xì)胞至終濃度約1x106/ml。。以每管1～2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍過(guò)夜。次日保存到液氮中。 

 

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial，融合瘤細(xì)胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。

 

 

（十三）如何避免細(xì)胞污染

 

細(xì)胞污染的種類可分成**、**、霉菌、病毒等。主要的污染原因?yàn)闊o(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染的血清和污染的細(xì)胞等。嚴(yán)格無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好的細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染的*好方法。

 

（十四）支原體 （mycoplasma）污染的細(xì)胞， 對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響

 

不能以肉眼觀察出支原體污染異狀。除極有經(jīng)驗(yàn)的專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無(wú)法以其外觀分辨。

 

支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞的生長(zhǎng)參數(shù)，代謝及研究任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為 mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)方有意義。

 

（十五）培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中，顏色會(huì)偏暗紅色，且 pH 值會(huì)越來(lái)越偏堿性

 

培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)的 CO2 會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性，而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑 （通常為 phenol red）的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果，將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)，可以通入無(wú)菌過(guò)濾 CO2 ，以調(diào)整 pH 值。或酸堿調(diào)PH。

 

（十六）L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

 

L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解，L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。

 

（十七）什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？

 

酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為 PH 值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

 

丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒(méi)有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。